Оптимальная толщина среза для повышения точности количественного анализа распределения флуоресцентных клеток и микросфер в криогенной среде.

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 10907 (2023) Цитировать эту статью

373 Доступа

Подробности о метриках

Криовизуализация эффективно использовалась для изучения биораспределения флуоресцентных клеток или микросфер на животных моделях. Последовательная флуоресцентная визуализация срез за срезом позволяет обнаруживать флуоресцентные клетки или микросферы для соответствующей количественной оценки их распределения в ткани. Однако если срезы слишком тонкие, произойдет перегрузка данных и чрезмерное время сканирования. Если срезы слишком толстые, то клетки могут быть пропущены. В этом исследовании мы разработали модель обнаружения флуоресцентных клеток или микросфер, чтобы помочь определить оптимальную толщину среза. Ключевые факторы включают: толщину среза (X), интенсивность флуоресцентных клеток (Ifluo), эффективный коэффициент ослабления ткани (мкТ) и порог обнаружения (Т). Модель предлагает оптимальное значение толщины среза, которое обеспечивает почти идеальную чувствительность при минимизации времени сканирования. Модель также предлагает метод коррекции для компенсации пропущенных ячеек в случае, если данные изображения были получены со слишком большой толщиной среза. Этот подход позволяет операторам криовизуализации использовать срезы большей толщины, чтобы ускорить время сканирования без значительной потери количества клеток. Мы проверили модель, используя реальные данные двух независимых исследований: флуоресцентных микросфер в сердце свиньи и флуоресцентно меченных стволовых клеток в мышиной модели. Результаты показывают, что зависимости толщины среза и чувствительности обнаружения, полученные в результате моделирования и реальных данных, хорошо совпадают с корреляцией 99 % и среднеквадратической ошибкой (RMS) 2 %. Мы также обсудили характеристики обнаружения в ситуациях, когда ключевые предположения модели не соблюдались, такие как изменение интенсивности флуоресценции и пространственное распределение. Наконец, мы показываем, что при правильных настройках криовизуализация может обеспечить точную количественную оценку биораспределения флуоресцентных клеток с чрезвычайно высокими коэффициентами восстановления (количество обнаружений/доставка). Поскольку технология криовизуализации используется во многих биологических приложениях, наши методы определения оптимальной толщины срезов и коррекции данных могут сыграть решающую роль в дальнейшем повышении ее удобства использования и надежности.

Криовизуализация — это технология трехмерной микроскопической визуализации, которая позволяет локализовать флуоресцентные клетки повсюду в организме мыши или крысы с чувствительностью к отдельным клеткам1,2,3,4,5,6,7,8,9. Система состоит из моторизованного микротома-криостата, микроскопа с возможностью светлого поля и флуоресценции, роботизированного позиционера и управляющего программного обеспечения. Для выполнения криовизуализации интересующие ткани быстро замораживают с использованием жидкого азота и фиксируют на стадии секционирования, при этом используется чередование срезов и визуализации. Система получает мозаичные изображения с большим полем зрения, высоким разрешением (~ 10 мкм), цветные светлопольные и флуоресцентные изображения ткани. Путем объединения фрагментов изображения можно создавать объемы трехмерных изображений для визуализации и анализа биораспределения. Эти исключительные особенности делают криовизуализацию уникальной по сравнению с другими методами трехмерной визуализации in vivo, такими как магнитно-резонансная томография (МРТ) или биолюминесцентная визуализация (БЛИ). Хотя такие методы визуализации in vivo позволяют получить изображение всего животного, им не хватает достаточного разрешения, и они могут создавать только изображения в оттенках серого. Благодаря вышеупомянутым функциям криовизуализация устраняет критический пробел в других методах визуализации биологических исследований.

Криовизуализация использовалась для изучения биораспределения флуоресцентных клеток или микросфер на различных моделях животных, включая мелких грызунов2,3,4,6,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. ,20, собаки7,21, свиньи5,22,23 и другие модели животных24. Берден-Гулли и др.13,14,15 использовали криовизуализацию для визуализации миграционного и инвазивного поведения клеток глиобластомы на мышиной модели. Недавно мы разработали платформу на основе криовизуализации для количественного определения и оценки флуоресцентных метастазов по всему телу мыши4,17,18,19. Было обнаружено, что платформа подходит для оценки и оптимизации линейки технологий (агентов визуализации, методов визуализации, терапии, моделей опухолей и т. д.), которые необходимы для обнаружения, понимания и лечения метастатического рака. Многие группы7,8,24,25, включая нашу собственную5,26, использовали эту технологию для пространственного разрешения количественной трехмерной перфузии миокарда с высоким разрешением с помощью метода захвата флуоресцентных микросфер. Ван Хорссен по эл. также использовали эту технологию для визуализации биораспределения как флуоресцентных микросфер7,21,22,23,27, так и флуоресцентно меченных моноцитов6 для исследования свойств прогрессирования коронарной неоваскуляризации в сердцах животных. Кроме того, ранее мы использовали технологию криовизуализации для изучения биораспределения внутривенно введенных стволовых клеток и болезнетворных иммунных клеток в организме мышей в модели реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ)2,3,9,10,11,12. ,20,28,29. Примеры флуоресцентных изображений, показывающих сигналы микросфер и сигналы стволовых клеток, показаны в дополнительном документе. Учитывая высокую полезность криовизуализации в исследованиях биомедицинской визуализации, появляется все больше приложений, использующих эту технологию.

100 µm) is often chosen. The benefits of a larger section thickness include faster imaging and computing times, less memory usage, and longer life for the sectioning knife. However, signals of dimly fluorescent cells embedded in a thick tissue may not reach the surface and may not be detected by the imaging system. The physics of signal loss can be described by the principles of light absorption and scattering in the biological tissue30,31,32,33. In general, by setting a slice thickness that is too large, a significant rate of false negatives can be expected. This would render the results unreliable, particularly in applications that demand accurate absolute quantification. On the other hand, if one sets the slice thickness to be too small, although accurate quantification can be obtained, it would not be computationally or economically efficient. For example, a tissue which can be imaged overnight (12 h) at 120 µm slice thickness will take 3 days (72 h) to scan at 20 µm. There is expected to be an optimal value for slice thickness that will give accurate cell/microsphere counting at a reasonable scan time./p>

20 µm, the number of detected cells will be less than the true number of cells in the tissue as shown in Fig. 3. This situation leads to false negatives. Next, we will propose a mathematical model of the relationship between the fluorescent cell detectability and the slice thickness especially in the sub-optimal range (X > Xoptimal)./p> Xoptimal), the number of detected cells decreases as the slice thickness increases. By formulating the mathematical relationship, one can predict the cell loss and even estimate a correction factor to compensate for the under-sampling. In this section, we aim to construct the relationship under some simplifications./p> Xoptimal (which implies e/X < 1.0), the number of observed cells (n) is reduced from the total cells in the sample (N) according to the relative distribution, d(x), of cells lying in a given slice. The distribution of cells is therefore also related to the probability of a cell being at a given distance, p(x). This can be formulated as/p> Xoptimal), the detection sensitivity decrease as the slice thickness increases. Also, remind that for all X values that are less than or equal to Xoptimal, the Sens value will be 100%. By combining X values from both ideal range (X ≤ Xoptimal) and sub-optimal range (X > Xoptimal), we obtain:/p> Xoptimal) would adversely affect the sensitivity. Three cell intensities were chosen for this simulation: Ifluo = 30, 50 and 80 (grayscale intensity). The numbers were chosen from the intensity distribution of cells derived from our stem cell imaging database. Parameters T and μT were set to 10 (gray level) and 314 cm−1, respectively. The detection threshold value (T) was empirically estimated based on the signal-to-noise-ratio (SNR) in our image data. The value of μT was estimated from mouse tissues in our database using an exponential fitting method proposed by Steyer et al.34. The programming platform used in this study was Matlab 2022a (MathWorks, USA)./p>

Xoptimal), the curve appeared as the reciprocal function derived in Eq. (14). By showing the relationship on a log–log scale, the relationship is shown to be perfectly linear (Fig. 6B), as predicted by the mathematical derivation described in Section “In silico simulations for non-compliant situations”./p> Xoptimal)./p> Xoptimal) (Fig. 10C,D)./p> Xoptimal). After running in silico simulations based on the assumptions, we made the following observations. When X ≤ Xoptimal, the Sens value was constant at 100%, but when X > Xoptimal, it decreased as a non-linear function of X (Fig. 6A). The relationship in the sub-optimal range was shown to be a reciprocal function of X Eq. (14). When plotted on a log–log scale, the relationship was linear with a slope of -1 (Fig. 6B). We speculate that this relationship would hold true for real data if the fluorescent cells behaved in a manner that was consistent with our key assumptions. Please note that we also developed a probabilistic model to predict the sensitivity profile in cases where the cell distribution is not uniform Eqs. (7)–(10) and with varying intensity Eqs. (16)–(17)./p> Xoptimal). In many applications, it is necessary for cryo-imaging users to choose a larger slice thickness in order to analyze a large piece of tissues such as pig hearts5,22,23,27, dog hearts7,21, or rabbit tissues24. As the sample volume is prohibitively large, a much larger slice thickness should be selected in order to efficiently optimize the imaging time, the memory space, and other costs. However, the larger the slice thickness beyond the Xoptimal value was, the higher the number of false negatives. In order to mitigate this issue, we propose that the relationship derived in Eqs. (14)–(15) can be used to estimate the true number of cells/microspheres. For example, if researchers conducted a microsphere biodistribution study in a large animal and needed to set a large slice thickness, say X = 100 μm while Xoptimal = 58 μm. By doing so, the cell signals acquired in their image data could be obtained with the sensitivity of only 58% (42% lost) as suggested by Eqs. (14)–(15). For correcting this, one may consider multiplying the number of found microspheres by a factor of 1/Sens (1/0.58 in our example) for estimating the true number of fluorescent microspheres in the tissue. This knowledge allows cryo-imaging operators to use larger slice thickness (much larger than Xoptimal) without significant loss of the microspheres. Such corrections could enable reduced scanning time of a large tissue such as a pig heart, going from days or weeks to hours or days. This finding makes that analyses feasible that may not previously be otherwise./p>

Новости